本文原载于中华眼科杂志,,56(04) :-.DOI:10./cma.j.cn-0207-
眼球内部组织通过血-眼屏障，建立了有别于其他组织器官的独特免疫微环境。部分眼内疾病可被局限于此微环境中，因而缺乏眼外表现；部分患者虽然全身具有系统性表现和辅助检查阳性结果，但也难以因此判断眼部表现与全身表现和结果间的关系。眼内液检测包括房水检测和玻璃体检测，可直接反映眼内微环境的多种信息，对多种感染性和肿瘤性疾病的诊断和鉴别诊断具有重要价值，其中部分检测指标还可用于病情随访，实时定量反应病情变化，并可用于预后判断[1,2,3,4]。
由于可获取的眼内液标本量常很少，传统检测手段很难同时获得足量的眼内信息，因此既往临床很少对眼内液进行检测。随着高通量和微量标本检测技术的发展，50μl眼内液标本即可同时用于核酸、细胞因子、抗原抗体等多项检测，眼内液检测的临床价值大大提升[3,5]。
房水因获取相对方便且安全，因而是眼内液检测最常见的标本类型。但是，房水的可获取量相对较少，通常仅~μl，浅前房患者则少于50μl。对主要累及眼后节的疾病，房水标本虽然也具有重要价值，但因其并不与病变部位直接接触，因而阳性率和代表性均相对不足。玻璃体标本的获取相对复杂且风险高，但对眼后节疾病而言，却是最佳标本类型，且玻璃体的可获取量远大于房水（至少μl），临床医师在送检标本时也不必捉襟见肘。
一、眼内液标本采集方法
（一）前房水标本采集法
前房水采集可在封闭的眼科检查室进行，也可在手术室进行。在眼科检查室采集房水时，因既不能严格消*也不能严格无菌操作，裂隙灯显微镜下只能单手操作且视野调整困难，在需要获取多量房水标本时既困难也不安全。手术室因具备完善的无菌环境，且采集时可严格执行无菌的双手操作，可以更加安全获取更多量的房水标本，因此推荐在手术室进行前房水标本采集过程。
按照眼内注药的手术标准消*和铺巾后，用胰岛素注射器（29G）或1ml注射器（26G）在操作方便位置于角膜缘后0.5mm平行于虹膜穿入前房，慢慢轻拉针栓，吸取前房水0.1~0.2ml。也可在穿刺前先拔掉注射器的针栓，待针头刺入前房后，利用眼内外压力差，等待房水自行缓慢流出至适当量后拔针。穿刺过程中注意勿伤及虹膜、晶状体和角膜内皮。术后结膜囊内给予抗菌眼膏，并用眼垫遮盖至少4h。
前房水取出后眼球处于低眼压状态。多数情况下，即便将房水抽干，随着房水生成，眼压也可自行恢复。但是，对于存在严重且广泛的活动性炎性反应的眼球而言，低眼压可诱发或加重脉络膜脱离；对急性视网膜坏死等原已存在发生视网膜裂孔风险的眼球而言，低眼压还可诱发视网膜裂孔和视网膜脱离。因此，对于此类患眼，在抽取房水后须用注射器向前房注入灌注液以恢复眼压。
（二）玻璃体标本采集法
玻璃体标本采集法包括注射器穿刺抽液采集法和依靠玻璃体切割机采集法2种。
1．注射器穿刺抽液采集法：
按照内眼手术步骤消*和表面麻醉后，将5ml注射器针头更换为2ml注射器的针头（23G），将针栓拉至1ml刻度处，于颞下方角膜缘后3.5mm处刺入眼球，针尖朝向眼球中心，直至在瞳孔区可见到针尖。缓慢轻拉针栓至4ml刻度处，等待液化的玻璃体缓慢流出0.2~0.5ml后，慢慢拔出针头。结膜囊内给予抗菌眼膏，并用眼垫遮盖至少4h。
该采集法的主要适用人群为玻璃体明显液化的高龄人群和玻璃体切除术后患者。（1）对于前者，因玻璃体液化多不均匀，只有针尖位于玻璃体内的"水囊"时方可抽出液体，若反复抽拉针栓均不能吸出玻璃体，则需要改变针尖在眼球内的位置再行尝试，或改用依靠玻璃体切割机采集法。由于在抽吸玻璃体过程中必然牵拉穿刺点对侧视网膜，因而发生视网膜裂孔、出血，甚至视网膜脱离和表面增生膜等并发症的风险较高。术前评估患眼玻璃体液化程度对保证操作过程安全和成功至关重要，对玻璃体液化尚不充分的患者禁用此方法。（2）对于后者，抽吸过程要缓慢轻柔，避免大量液化玻璃体被吸出，使眼压骤降而引起出血等眼内并发症。
2．依靠玻璃体切割机采集法：
按内眼手术步骤消*和球后阻滞麻醉后，分别于鼻上方和颞下方角膜缘后3.5mm处巩膜，经结膜放置25G或27G灌注套管。打开玻璃体切割机并调至玻璃体切割模式，设置切割速度为0~次/min，打开灌注水管的水止，排净管内气泡后再次关闭水止，将灌注头插入颞下方的灌注套管中，用无菌贴膜或胶布固定灌注水管。将玻璃体切割头废液管上的驳接口打开，在靠近切割头一侧的驳接口上连接2ml或5ml注射器后，将其从鼻上方灌注套管伸入眼内至在瞳孔区可见其眼内位置。缓慢踩下玻璃体切割机踏板的同时，轻拉连于玻璃体切割头上的注射器针栓，待玻璃体液缓缓流出0.2~0.5ml后停止拉动针栓，在不松踏板的同时，慢慢将玻璃体切割头拉出至眼外。打开灌注水管的水止，让灌注液流入眼内恢复眼压后，移除鼻上和颞下的灌注套管，结膜囊内给予抗菌眼膏，眼垫遮盖至少4h。
对还需要获得玻璃体灌洗液的患者，可在打开灌注水管的水止后，更换玻璃体切割头上的注射器，继续一手持玻璃体切割头于眼内可见位置，另一手在踩下踏板的同时，拉动针栓吸取玻璃体灌洗液，直至注射器收集满液体后再拔出玻璃体切割头。
此方法为玻璃体标本采集最为安全有效的方法，适用于需要采集玻璃体标本的各类人群，但因需要使用玻璃体切割机而操作繁琐且成本较高。对原本就需要行玻璃体切除手术的患者而言，在彻底清除玻璃体前用此方法采集玻璃体标本最为经济划算。
二、眼内液标本检测方法
眼内液检测内容包括病原学检测、细胞因子检测、细胞病理或免疫表型分析和基因重排检测。房水标本因量少而仅适合进行微生物涂片镜下检测和聚合酶链反应（polymerasechainreaction，PCR）检测，玻璃体原液标本因量多，可分装后分别进行微生物涂片镜下检测、微生物培养和PCR检测。玻璃体灌洗液标本虽然不能进行细胞因子和抗体等需要定量检测的项目，但对全真菌或全细菌PCR检测和细菌、真菌培养等仅需定性检测的项目，仍具有重要价值。增加标本量可明显增加微生物培养的阳性率[6]。
（一）病原学检测
眼内液的病原学检测包括直接病原体检测（涂片和培养）、病原体抗原检测、病原体抗体检测和病原体核酸检测。
1．病原体涂片和培养：
病原体涂片和培养是最传统也是最直接的病原学鉴定方法。取出的眼内液标本须在2h内完成涂片镜下检测，以确保病原体未解体且形态特点清晰可辨。因眼内液标本量少且引起眼内感染的病原体多为需氧型或兼性需氧型细菌和真菌，送检培养时最好使用儿科用微生物血培养瓶，以便提高阳性率[7]。若仅有需氧型和厌氧型微生物血培养瓶时，则仅使用需氧型培养瓶即可，避免标本分装浪费标本而进一步降低阳性率。若眼内液标本量足够多（如玻璃体灌洗液），则应尽可能将标本分为2等份，分别注入需氧型和厌氧型微生物血培养瓶中，以提高结果的阳性率[7]。若培养对象为结核分枝杆菌，需使用结核分枝杆菌专用培养容器，其他培养瓶均不能用于培养结核分枝杆菌[7]。
2．病原体抗原检测：
病原体抗原检测因操作繁琐且对标本量需求较大，目前已基本不再使用。曾经用于临床诊断的检测内容包括巨细胞病*pp65抗原、pp67mRNA抗原等。
3．病原体抗体检测：
眼内液抗体检测对确定眼内感染性疾病的病因具有重要价值，目前临床仍在使用的抗体检测方法包括直接凝集试验、间接免疫荧光法、免疫吸附凝集试验、酶联免疫试验、免疫印迹法（immunoblot，IB）等。需强调的是，眼内液检测到某病原体抗体阳性时，尚不能确定此病原体与眼内感染性疾病的关系，还需要计算Goldmann-Witmer系数（Goldmann-Witmercoefficient，GWC）=（眼内液某病原体特异抗体/眼内液总抗体）/（血清某病原体特异抗体/血清总抗体）。若GWC3则表明眼内液中病原体特异性抗体为眼内感染性疾病所致原位生成的抗体，而非其他感染性疾病导致的血液中相应抗体进入眼内[8]。因感染启动至抗体生成需要间隔时间，故眼内液抗体检测时间过早（10d）或过晚（6个月）均可能得到阴性结果，通常感染后约1个月是GWC阳性率的达峰时间[9]。IB是抗体类检测的金标准方法，特异性高但敏感性低，与其他方法联合使用方可获得最大实效[9]。
4．病原体核酸检测：
PCR仅需痕量级标本即可同时检测多种病原体的核酸成分，且简单易行，是目前最适合眼内液标本的病原学检测技术[10]。因PCR检测对标本内模板浓度要求低，因此对于眼后节感染性疾病，房水标本、玻璃体原液标本甚至稀释的玻璃体灌洗液标本均可使用[11,12]，这也是PCR病原学检测的一大亮点。PCR检测不但能定性发现眼内液标本中是否存在某种病原体的核酸，还能通过实时定量技术确定其载量，以监测治疗过程中眼内病原体对药物的反应[13]。
20世纪90年代出现的全细菌16SrRNA[14]和全真菌18/28SrRNA[15]PCR技术，极大扩展了传统PCR检测只能针对已知核酸序列和特定病原体的局限性，通过对所有细菌均含有的16SrRNA核酸序列和所有真菌均含有的18/28SrRNA核酸序列进行检测，即可明确标本中是否存在细菌和真菌。虽然此种方法不能直接确定病原体的种类，仅可确定"有无"，但对PCR产物进行测序，再利用生物信息学技术检索，即可获得病原体种属信息，非常符合现代小样本、高通量检测的趋势[16]。
目前已有大量研究结果表明，PCR检测是眼内病*类病原体的首选检测方法，其敏感性和特异性均大于90%[17,18]，但其对于寄生虫类病原体的检测精度则劣于抗体类检测方法（GWC法等）。但无论针对何种病原体，联合使用PCR和GWC法检测，均可提高检测的敏感性和特异性[19]。
（二）细胞因子检测
细胞因子可反映眼内组织的免疫和代谢状态[5]，不仅具有重要的科研价值，而且对某些特定疾病还具有重要的诊断价值[20]。随着微量标本高通量检测技术的发展，酶联免疫吸附法因对标本量需求大且单次操作仅能定量一种靶分子浓度，已逐渐不再用于眼内液检测，而流式微球阵列法和阵列免疫发光法等单次仅消耗50~μl标本即可同时检测至少6种细胞因子的检测方法，是目前的主流检测方法。眼内液白细胞介素（interleukin，IL）6和IL-10的浓度比值1，则高度提示B细胞来源淋巴瘤的可能[19,21]；眼内液血管内皮细胞生长因子（vascularendothelialgrowthfactor，VEGF）浓度升高表示眼内组织存在缺血缺氧，是新生血管性青光眼发生的直接原因，而抗VEGF治疗可直接降低眼内VEGF浓度。
（三）细胞病理学和免疫表型分析
淋巴瘤和黑色素瘤等眼内肿瘤性疾病的诊断金标准仍是眼内细胞病理学[22]，对临床或其他辅助检查高度怀疑眼内肿瘤，且眼内液标本可在不影响预后的情况下获取时，须行眼内液标本细胞病理学和免疫表型分析，玻璃体为首选标本类型[23]。此时因需要获取相对大量的玻璃体标本，须使用依靠玻璃体切割机标本采集法。为保证细胞完整，切割速度设置为0~次/min。为保证细胞具有良好且可辨识的形态，获取的标本原液应在取出后2h内完成镜下检测。玻璃体灌洗液可用于进行流式细胞免疫表型分析，进一步分析眼内免疫细胞的种类和比例。因流式细胞免疫表型分析是基于大样本的细胞计数法，当灌洗液内细胞过少时可能无法进行，获取足量的灌洗液并对其进行离心沉淀浓缩，可提高结果质量。因用于流式细胞检测的标本不能固定，故灌洗液也应在获取后尽快进行检测，若间隔时间长，可暂将标本在4℃环境下静置保存，但取样与检测的间隔时间不应超过12h。
（四）免疫球蛋白重链（IgH）/T细胞受体（Tcellreceptor，TCR）基因重排检测
B细胞和T细胞在分化发育过程中，其白细胞抗原基因会发生重组，形成具有"细胞指纹"特征的独一无二的IgH和TCR基因型。各种慢性淋巴细胞增生性疾病和B细胞相关肿瘤性疾病，IgH/TCR将发生单克隆增殖，其拷贝数可反映疾病的活跃程度[21]。对其重排的克隆多样性进行检测，有助于疾病诊断。对其进行定量分析，更对疾病的预后、复发和个体化治疗方案制定，具有重要的指导意义[22]。
IgH/TCR基因重排检测的途径包括常规细胞遗传学、Southern分子杂交、PCR和荧光原位杂交等。因眼内液标本量少且细胞密度低，PCR检测尤其实时定量PCR检测是最常用的方法[24]。借助实时定量PCR检测的熔解曲线，不仅可以明确标本中是否存在单克隆的B/T细胞克隆，而且可依据产物的Tm值区分碱基序列不同的产物。
对肿瘤性疾病而言，基因重排多发生于恶性转化之前，因此大多数淋巴细胞肿瘤性疾病均可检测到单克隆的IgH/TCR基因重排结果。但是，若恶性转化发生于基因重排之前，则无法检测到单克隆的IgH/TCR基因，因此基因重排检测结果阴性不能完全排除肿瘤类疾病的可能[25]。
随着微量和高通量检测技术的进步，少量房水和玻璃体标本可提供的临床信息将越来越多，对临床诊断、鉴别诊断、疗效随访和预后判断的价值将越来越大。但需强调的是，眼内液采集毕竟是有创操作，眼内液检测也终究是辅助检查。从采集病史、眼科专科检查、眼科专科辅助检查，到系统性辅助检查、眼内液检测，仍然是眼科临床实践应遵循的一般步骤，过度强调眼内液检测而忽视病史采集和眼科专科（辅助）检查的做法不可取[11,26]。虽然眼内液检测对多种眼内感染性和肿瘤性疾病的诊断和随访具有重要价值，但其对非感染性眼内炎性反应和血管性疾病等的作用非常有限，至今也尚未有任何一个非感染性眼内炎性反应疾病的诊断标准中包含眼内液检测的相关内容。此外，对确实需要进行眼内液检测的患者，临床医师应根据患者的临床信息尽可能缩小临床诊断的"包围圈"，并根据临床表现有的放矢地选择有针对性的眼内液检测项目，避免"大包围"式的无效检测给患者带来经济负担以及无用的假阳性结果给诊疗工作带来信息干扰[10]。
利益冲突
利益冲突 所有作者均声明不存在利益冲突
预览时标签不可点收录于话题#个上一篇下一篇
